国产精品国产精品国产专区不,精品人妻中文字幕一区二区,国产精品欧美久久久久无广告,日韩专区欧美中文字幕

產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST

首頁 > 技術(shù)與支持 > 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)必看干貨小結(jié)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)必看干貨小結(jié)
點(diǎn)擊次數(shù):98 更新時(shí)間:2024-09-02

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。通常我們會(huì)重點(diǎn)關(guān)注Ct值(Cycle threshold ,Ct),其含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。


熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。其原理如下:
1、TaqMan熒光探針:
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步。
2、SYBR熒光染料:
在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步。
熒光染料也稱DNA結(jié)合染料,目前主要使用的染料分子是SYBR Green I,SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合,游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號(hào),但結(jié)合雙鏈DNA后,其熒光信號(hào)可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加,PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大,其熒光信號(hào)強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

我們將這條熒光擴(kuò)增曲線人為地分為基線期、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期三個(gè)階段:
1、基線期,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所覆蓋,我們無法判斷熒光強(qiáng)度的變化。
2、擴(kuò)增期,熒光信號(hào)呈指數(shù)增長,擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關(guān)系,在此階段可定量分析。
3、平臺(tái)期,由于底物耗盡等因素.熒光信號(hào)不再呈指數(shù)增加。


RT-qPCR原理的三個(gè)主要步驟:

1 反轉(zhuǎn)錄:

使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。

反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。

 

2 、PCR擴(kuò)增:

使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。

PCR是一個(gè)循環(huán)過程,呈指數(shù)級擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。

PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針,它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號(hào)。

 

3 、熒光實(shí)時(shí)檢測:

使用實(shí)時(shí)PCR儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)。

熒光的數(shù)量與每個(gè)PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。

使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值(Ct)值,該值表示熒光信號(hào)達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計(jì)算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量,從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。


實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中有幾個(gè)重要的概念,包括擴(kuò)增曲線、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù)。
1、擴(kuò)增曲線(amplification curve:
是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號(hào)隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進(jìn)行PCR反應(yīng)過程中,通過檢測系統(tǒng)對PCR管內(nèi)的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測,最后將熒光信號(hào)值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上。正常的擴(kuò)增曲線包括四個(gè)階段:基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺(tái)期。
2、基線(baseline):
是背景曲線的一段,在擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里熒光信號(hào)變化不大,接近一條直線。
3、熒光閾值(threshold):
是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。
4、閾值循環(huán)數(shù):
表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),研究表明,各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,即起始拷貝數(shù)越多,CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),CT值為縱坐標(biāo)的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要獲得未知模板的CT,即從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該模板的起始拷貝數(shù)。

午夜狂情三级伦理涩之屋-亚洲国产精品美女嫩模综合在-久热在线观看免费视频-国产精品伦子一区二区三区| 日韩亚洲高清在线一区二区三区-国产无遮挡爆操美女老板-伊人久久亚洲精品国产av-国产亚洲综合成人在线| 亚洲精品一区网站在线观看-亚洲精品一区二区三区婷婷月-国产aⅴ精品一区二区三区久久-在线综合亚洲中文精品| 五月婷婷丁香免费视频-四虎永久免费观看在线-一品道亚洲欧美日韩精品-日韩一级黄色片在线播放| 日韩av毛片在线播放-亚洲一区二区在线观看网站-18禁网站在线免费观看-亚洲精品夜夜黄无码99| 久久久精品国产亚洲av高清涩受-国产精品一区二区三区成人-欧美日韩国产精品视频一区二区三区-大陆美女阴户特写毛片| 国产精品蜜桃久久一区二区-久久精品熟女亚洲av麻豆蜜臀-日本一区二区精品色超碰-伊人一区二区三区久久精品| 四虎在线观看永久免费-久久精品熟女亚洲av香蕉-av国内精品久久久久影院三级-亚洲国产一区二区三区av| 亚洲一区二区日韩精品在线观看-白浆高潮国产免费一区二区三区-热久久这里只有精品99-亚洲精品在线观看中文字幕| 亚洲少妇视频免费观看高清-亚洲午夜福利在线播放-偷拍偷窥精品视频在线-黄色大片国产免费永久网站| 亚洲精品毛片免费观看-精品一区二区三区四区激情-特黄特色大片女生高潮久久-欧美午夜福利视频自拍| 亚洲国产精品一区二区三区视频-午夜福利国产一区二区在线观看-亚洲欧美成人中文字幕-青青草好吊色在线视频| 乱中年女人伦中文字幕久久-国产成人高清免费视频网站-中文字幕亚洲人妻在线视频-中文字幕剧情av在线| 一区二区在线观看黑人-久久久精品人妻一区二区三区综合-成人内射国产免费观看-四虎在线免费视频观看| 日本亚洲午夜福利视频-欧美日韩高清精品一区二区-av成人免费在线视频-日韩精品一区二区三区费暖暖| 国产精品欧美日韩视频二区-少妇人妻系列中文在线-精品人妻一区二区三区四区不卡-少妇被无套内谢免费视频| 亚洲乱色熟女一区二区三区蜜臀-亚洲精品午夜在线免费观看-综合成人亚洲偷自拍色-色综合久久精品中文字幕| 少妇无套内谢免费视频-色婷婷性感在线观看视频-国产免费黄色一级大片-国产亚洲精品麻豆一区二区| 欧美黄色在线观看免费-日本高清精品一卡二卡-日本综合精品一区二区在线-国产精品伦人一久二久三久| 粉嫩精品一区二区三区在线观-中文国产精品久久久私一本-熟女少妇日韩亚洲av-精品国产一区二区三广区精东| 久久女婷五月综合色啪色老板-国内不卡的一区二区三区中文字幕-在线观看一区二区三区日韩-五月天丁香婷婷狠狠狠| 精品人妻一区二区三区久久91-久久精品亚洲国产av搬运工-日本熟女人妻一区二区三区-亚洲国产精品高清线久久| 中文字幕在线永在少妇-97免费公开在线视频-国产三级自拍视频在线播放-黄色aaa三级三级三级| 五月婷婷丁香免费视频-四虎永久免费观看在线-一品道亚洲欧美日韩精品-日韩一级黄色片在线播放| 一区二区三区四区五区黄色-色哟哟精品免费专区在线-很色精品99在线观看-亚洲一区二区三区精品久久| 尤物视频在线观看网址-欧美午夜精品久久福利-久久这里只有精品视频5-国产精品成人综合色区| 在线视频观看一区二区三区-日韩成年人高清精品不卡一区二区-成人深夜节目在线观看-亚洲精品中文字幕一二三| 久久av这里只有精品-国产三级视频不卡在线观看-精品亚洲综合久久中文字幕-在线观看日韩av系列| 五月婷婷丁香综合入口-日本少妇免费中文字幕-96青草视频在线观看-中文字幕成人精品久久不卡| 国产偷拍自拍视频在线观看-丰满欧美熟妇视频在线-亚洲午夜激情在线观看-四虎视频精品免费观看| 亚洲天堂男人的天堂在线-亚洲激情欧美日韩在线-国产av剧情精品老熟女-色老头与人妻中文字幕视频| 91精品在线播放黑丝-在线观看精品国产自拍-av免费在线播放日韩-日韩av在线精品一区二区三区| 久久噜噜噜精品国产亚洲综合-91精品国产高清久久福利-精品国产一区二区三区麻豆-日本加勒比一区二区在线观看免费| 蜜臀一区二区在线观看视频-亚洲一区二区国产精品视频-国内精品国产三级国产a久久-婷婷久久亚洲中文字幕| 玩弄漂亮少妇高潮大叫-国产熟女露脸av自拍-国产自拍免费精品视频-日韩精品素人妻在线看| 国产一区二区三区四区在线播放-国语精品国内自产视频-可以免费看黄的网久久-久久久亚洲av三吉彩花| 妖精亚洲av成人精品一区二区-精品日韩一区二区三区av-在线精品国精品国产尤物-在线播放国产精品三级网| 国产精品久久久久久野战-人妻少妇中文字幕在线一区-国产自拍日韩在线视频-少妇宅女午夜福利院免费| 国产精品人成在线播放蜜臀-老司机午夜福利视频在线-亚洲激情av免费观看-国产情侣91在线观看| 一区二区三区岛国av毛片-国产男女无遮挡猛进猛-久久精品人妻丝袜乱一区二区三区-国产超级对对碰在线观看| 国内外成人综合免费视频-久久国产精品99久久蜜臀-大三美女口爆吞精视频-亚洲国产一区二区精品性色|