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Western一抗二抗去除液

簡要描述:

Western一抗二抗去除液公司正在出售的產(chǎn)品:家貓皮膚成纖維細(xì)胞 嗅覺受體5AS1封閉多肽 極小棒桿菌PCR檢測試劑盒 大鼠髓磷脂堿性蛋白(MBP)試劑盒 ELISA 順烏頭(ACO)活性比色法檢測試劑盒 北極假交替單胞菌 糖基轉(zhuǎn)移樣1抗體

更新時間:2024-01-12

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Western一抗二抗去除液

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

A-PJ1108

Western一抗二抗去除液

100ml

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Western 一抗二抗去除液,用于 Western Blot 中轉(zhuǎn)移了蛋白的膜的重復(fù)利用。在 Western Blot 中完成了一抗二抗結(jié)合和后續(xù)的化學(xué)發(fā)光檢測后,有時還需要檢測 Actin、Tubulin 等內(nèi)參蛋白或檢測其它蛋白進(jìn)行比較。Western 一抗二抗去除液可變性已經(jīng)結(jié)合的抗體,使其失活,從而將同一張膜再用于其它抗體的雜交。與其它類型的一抗二抗去除液相比,該試劑不破壞抗原,處理過程中膜上抗原不丟失,因此可重復(fù)應(yīng)用的次數(shù)更多、靈敏度更高。
特征
操作簡單快速不會造成抗原蛋白的損失。
儲存:室溫可保存 2 年。
注意:該試劑為強(qiáng)烈的氧化劑,實驗時務(wù)必做好防護(hù)工作。
如試劑接觸到皮膚,請用大量的水沖洗,并盡快就醫(yī)。
操作方法
(1) 將雜交完畢的膜置入蒸餾水中,室溫漂洗 5min。
(2) 漂洗結(jié)束后,棄去蒸餾水。
(3) 加入適量 Western 一抗二抗去除液(至少可覆蓋膜表面),室溫孵育 15min。
(4) 孵育結(jié)束后,棄去 Western 一抗二抗去除液。
(5) 加入適量蒸餾水,室溫漂洗 5min×4 次;漂洗結(jié)束后棄去蒸餾水。注意:每次漂洗務(wù)必將廢液倒干凈。
(6) 然后進(jìn)行封閉等后續(xù)操作,直至完成 Western Blot。

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PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?

試劑:
模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴(kuò)增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
設(shè)備:
PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制;電泳槽:用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗:

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成,每個循環(huán)包括以下3個步驟:

一、變性:

利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性:

在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸:

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:

1、變性溫度和時間:

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜WC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。

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